Stanovení sekvence nukleotidů v molekulách nukleových kyselin

Jak známo jsou nukleové kyseliny tvořeny různě dlouhými řetězci nukleotidů, z nichž každý obsahuje zbytek kyseliny fosforečné, dusíkatou bázi a pětiuhlíkatý cukr. Žerdí jsou navzájem pospojované zbytky kyseliny fosforečné s pentózou, na kterou jsou připojeny dusíkaté báze, které v případě dvouřetězcových molekul vytvářejí vodíkovými vazbami příčky mezi oběma řetězci.

K sekvenaci tedy určení sledu dusíkatých bází, který jediný v sobě nese informační obsah, používáme obvykle jen jeden řetězec, i když existují přístupy, které dovolují stanovení sekvenci v obou řetězcích současně (elektronová mikroskopie).

Metody sekvenace nukleotidů

Nejdéle a nejčastěji používaná je metoda Langerova, založená na syntéze komplementárního řetězce podle zkoumaného vzoru. Do reakce, která je prováděna polymerázou, vstupují základní stavební kameny, jakými jsou nukleosidtrifosfáty, které jsou zároveň dodavateli potřebné energie. Díky značné preferenci k tvorbě vodíkových vazeb jsou do nového řetězce řazeny dusíkaté báze tak, že proti cytosinu v řetězci vzorovému je umístěn guanin a proti adeninu thymin a vice versa.

Aby bylo možné určit, na které místo byl zařazen nukleotid s určitou bází jsou do směsi přidány nukleosidtrifosfáty, které syntézu ukončí, protože za ně nelze již připojit další. Ve směsi jsou tedy obsaženy všechny čtyři normální nukleosidtrifosfáty a navíc jejich dideoxy formy. Přitom koncentrace těchto syntézu ukončujících forem je ve směsi nepatrné množství.

Máte zájem o sekvenaci nukleotidů? Kontaktujte nás, doručení výsledků garantujeme do tří pracovních dní.

Sekvenace DNA včera a dnes

Tak vzniká velké množství různě dlouhých nově syntetizovaných řetězců, které mají všechny na svém konci jednu ze čtyř dideoxy forem. Ty jsou dnes označeny různými barvami a můžeme tak jednotlivé řetězce od sebe odlišit. V době, kdy barevné značení nebylo k dispozici a používalo se značení radioaktivní, bývalo nezbytné provádět sekvenci pro každou bázi samostatně ve zvláštní zkumavce. K identifikaci vzniklých oligonukleotidů byla použita elektroforéza – původně v akrylamidovém gelu, později kapilární – ta je používána dodnes. Výsledkem jsou obrazy za sebou následujících vrcholů, neboť oligonukleotidy se navzájem liší ve velikosti pouze o jeden nukleotid.

Později byla vyvinuta metoda pyrosekvenace, jejíž autoři téměř zapadli v zapomenutí. Zařazení nukleotidu do nově syntetizovaného řetězce je signalizováno světelným zářením vznikajícím účinkem luciferázy. Ve směsi pro pyrosekvenování je kromě ní být přítomno velké množství enzymů, mimo DNA polymerázy ještě ATP sulfuryláza, a apyráza; ze substrátů pak adenosinfosfosulfát a luciferin. Reakce probíhá tak, že jsou postupně přidávány a domývány jednotlivé deoxyribonukleotidy. Po přidání toho, který je zařazen se spustí řetěz reakcí, který vede k uvolnění světelného záření.

Nevýhody pyrosekvenace

Nevýhodou pyrosekvenace je vyšší náročnost na chemikálie a špatné odlišení vyššího počtu za sebou následujících nukleotidů se stejnou bází. Proti metodám, které zaplavily svět v posledních deseti letech, mají tyto starší výhodu v tom, že výsledky lze dobře kontrolovat, neboť je získáváme v podobě křivek a případné nedostatky odstranit, což sice vyžaduje jistou zkušenost při rozhodování o tom, co je skutečností a co je zřejmě chybou metodickou.

Sekvenování nové generace

Nové technologie sekvenování s vysokou automatizací jsou označovány jako Sekvenování nové (příští) generace (NGS). Většinou pracují podobně, jako tomu bylo při práci na projektu HGP prováděnou firmou Celera, která vycházela z ohromného množství štěpů lidské DNA, které bylo možné sekvenovat klasickým způsobem a následně jejich sekvence díky překrývajícím se zakončením navzájem pospojovat.

Minimální míra chybovosti

Většina dnes užívaných technologií výrobci sekvenačních strojů vychází z různě dlouhých štěpů DNA – jejich tzv. knihoven, sekvence štěpů seřadí pomocí počítačových programů do správného pořadí. Všechny způsoby sekvence mají určitou míru chybovosti, kterou lze u klasických metod potlačit „okometrickou“ kontrolou pracovníka. Tu stroje nových generací postrádají a potlačují ji mnohonásobným opakováním – analýzou téhož vzorku – vzniklých štěpů. Jinak řečeno „přečtou“ danou zprávu mnohokrát.

Chyby při sekvenačních reakcích mohou vznikat tím, že zpracováváme směs DNA z různých buněk. U normálních tkání předpokládáme, že jejich genom všech buněk je identický, což např. nemusí platit pro mitochondriální DNA, ale určitě neplatí pro nádorové tkáně. Dalším krokem, který je častou součástí celého sekvenačního procesu, je polymerázová reakce, která opět není reakcí bezchybnou. Konečně jak již bylo zmíněno sekvenační reakce samy mohou chybovat v identifikaci a řazení nukleotidů tam, kde se ve zkoumané DNA nacházejí opakující se sekvence nejrůznější délky, případně došlo k přesunům, ztrátám nebo insercím. Čím jsou analyzované fragmenty delší, tím lépe se takové odchylky odhalují.

Pro sekvenaci DNA se používají stroje Illumina a Roche

Za celosvětově nejrozšířenější lze považovat stroje druhé generace, které vyrábí firma Illumina, v tuzemsku pak díky šikovnému marketingu stroje vyráběné firmou Roche. Stroje firmy Illumina pracují s relativně krátkými fragmenty a jsou používány převážně k resekvenaci lidského genomu, kdy s výhodou využívají skutečnosti, že sekvence lidského geonomu je již známa, což usnadňuje řazení sekvenovaných úseků. Naproti tomu stroje firmy Roche pracují s delšími fragmenty a jsou lépe použitelné pro sekvenace „de novo“.

Sekvenace budoucnosti

V posledních letech se začaly objevovat i stroje tzv. třetí generace, které vycházejí z představy W.Ansorgeho, který navrhl postup přímého sekvenování řetězců nukleotidů velkých délek bez potřeby amplifikace. Jedním z prvních strojů této generace byl sestaven firmou Pacific Biosciences, v nichž miniaturních studničkách jsou ukotveny molekuly polymerázy, která podle vzorového řetězce syntetizuje řetězec nový. Při zařazení každého nového nukleotidu dojde k vývinu fluorescence a detektor podle barvy určí zařazený nukleotid.

Ještě více se Ansorgově představě blíží stroje vyvíjené firmou Oxford Nanopore a již dodávané firmou Life Technologies. Nedostatkem těchto strojů bývá to, že na trh jsou vlastně uváděny ve stavu prototypu. V minulém roce se na scéně začaly objevovat další stroje dokonce označované jako čtvrtá generace, ale spíše jde o nejrůznější varianty, které se proplétají mezi dříve uzavřenými patenty – což ostatně dokazuje velké množství patentových sporů mezi výrobci.

Vyhodnocení sekvenace za pomoci počítače

Za zcela zásadní součást všech strojů nových generací je třeba považovat převod „surových“ dat do „smysluplné“ a „správné“ podoby. K dispozici je sice řada počítačových programů, a stále přibývají nové, ale již nepředstavují automatizovanou část celého procesu, ale vyžadují účast odborníka, většinou z oboru jakým je bioinformatika. A i v jeho rukách může vyhodnocení sekvenčních nálezů vyžadovat poměrně dlouhou dobu.

Současná doba značně urychluje posun našeho poznání, především vývojem nových technologií, což se na výrobcích, mezi které jistě sekvenční stroje patří rychlým „ideovým“ stárnutím, za čímž bohužel obvykle pokulhává doba odpisování. Proto je výhodné takové stroje maximálně využívat, aby vytvořily dostatek prostředků potřebných k nákupu strojů nových.

Ušetřete outsourcingem sekvenace

Proto vznikají instituce většinou soukromé, které nabízejí sekvenování jako službu. Z hlediska ekonomiky jsou velmi hospodárné, protože podobně jako letecké společnosti nenechávají letadla stát na zemi, ale snaží se, aby byla stále ve vzduchu, i sekvenační stroje mohou pracovat prakticky v nepřetržitém provozu. Tyto společnosti většinou disponují větším počtem různých sekvenátorů a mohou si pro různé úkoly vybírat ty nejvhodnější a rovněž mají týmy odborníků s náležitým počítačovým vybavením – některé dokonce jsou vybaveny superpočítači, čímž zřetelně urychlují celý proces, který z několika týdnů dokážou zkrátit na několik málo dnů. Existují dokonce společnosti, které sice sekvenační stroje vyrábějí, ale neprodávají a používají je jen pro svou vlastní potřebu např. Complete Genomics – jako službu. V současnosti se odehrává pokus o zakoupení této americké firmy, Čínským genetickým institutem.

V případě sekvenace a zvláště v podobě celogenomového sekvenování lidské DNA, by na závěr měla být provedena lékařská interpretace laboratorního nálezu, což již některé instituce v rámci svých služeb nabízejí. Jde o nejzávažnější a zatím ještě pouze rozvíjenou problematiku.