Virus opičích neštovic Real Time PCR Kit, 25 reakcí

Detailní popis

Účel použití

Virus opičích neštovic Real Time PCR kit je test pro detekci viru opičích neštovic ve vzorcích séra nebo exsudátu z lézí

Princip PCR v reálném času

Princip detekce v reálném čase je založen na fluorogenním 5'nukleázovém testu. Během PCR reakce DNA polymeráza štěpí sondu na 5' konci a odděluje reportérové ​​barvivo od zhášecího barviva pouze tehdy, když sonda hybridizuje s cílovou DNA. Toto štěpení má za následek uvolnění fluorescenčního signálu díky štěpení reportérového ​​barviva, který je monitorován v reálném čase pomocí PCR detekčního systému. Cyklus PCR, při kterém dochází ke zvýšení fluorescenční signálu je detekován (Ct) a je úměrný množství specifického PCR produktu. Monitorování intenzity fluorescence v reálném čase umožňuje detekci akumulace produktu, aniž by bylo nutné znovu otevírat reakční zkumavku po amplifikaci.

Popis produktu

Virus opičích neštovic je virus, který způsobuje onemocnění opičích neštovic jak u lidí, tak zvířat. Virus opičích neštovic je orthopox virus, rod z čeledi Poxviridae, který obsahuje další virové druhy, které infikují savce. Virus se vyskytuje hlavně v tropických deštných pralesech v oblastech střední a západní Afriky. Primární cestou infekce je považován kontakt s infikovanými zvířaty nebo jejich tělesnými tekutinami. Genom není segmentován a obsahuje jedinou molekulu lineární dvouvláknové DNA o délce 185 000 nukleotidů.

Virus opičích neštovic Real Time PCR kit obsahuje specifický systém ihned připravený k použití pro detekci viru opičích neštovic pomocí polymerázové řetězové reakce (PCR) v systému real-time PCR. Master mix obsahuje činidla a enzymy pro specifickou amplifikaci DNA viru opičích neštovic. Fluorescence je vyzařována a je měřena optickou jednotkou real time systémů během PCR. Detekce amplifikovaného DNA fragmentu viru opičích neštovic se provádí ve fluorimetrickém kanálu FAM s fluorescenčním zhášečem BHQ1. DNA extrakční pufr je k dispozici v kitu a vzorky séra nebo exsudátu z lézí se používají pro extrakci DNA. Navíc kit obsahuje systém pro identifikaci možné inhibice PCR pomocí měření fluorescence HEX/VIC/JOE interní kontroly (IC). Dodávaná externí pozitivní kontrola je definovaná jako 1×10^7 kopií/ml a umožňuje stanovení genové zátěže. Další informace naleznete v části 10.3 Kvantifikace

Obsah kitu

Citlivost analýzy: 5×10^3 kopií/ml

LOQ: 1×10^4~1×10^8 kopií/ml

Poznámka: Citlivost analýzy závisí na objemu vzorku, objemu eluce, metodě extrakce nukleových kyselin a dalších faktorech. Pokud použijete DNA extrakční pufr v kitu, citlivost analýzy je stejná, jak se deklaruje. Když je však objem vzorku desetkrát nebo dokonce stokrát větší než eluční objem díky koncentrační metodě, může být mnohem vyšší.

Skladování

• Všechny reagencie by měly být skladovány při -20°C. Skladování při +4°C není doporučeno.

• Všechny reagencie lze používat do data expirace uvedeného na obalu kitu.

• Je třeba se vyhnout opakovanému rozmrazování a zmrazování (>3x), může to snížit citlivost testu.

• Během pracovních kroků všechna činidla udržujte v chladu.

• Super mix by měl být skladován v temnu.

Dodatečně požadované materiály a zařízení

• Biohazard box

• Vortex

• Kryokontejner

• Sterilní špičky s filtry pro mikropipety

• Jednorázové rukavice, bez pudru

• Lednička a mraznička

• Real time PCR systém

• Real time PCR reakční zkumavky/destičky

• Pipety (0,5μl – 1000μl)

• Sterilní mikrozkumavky

• Nádoba na biologický odpad

• Stojany na zkumavky

• Stolní mikrocentrifuga pro zkumavky typu „eppendorf“ (RCF max. 16 000 x g)

Varování a bezpečnostní opatření

• Před zahájením postupu si pozorně přečtěte tento návod.

• Pouze pro diagnostické použití in vitro.

• Tento test musí provádět kvalifikovaný personál.

• Klinické vzorky by měly být považovány za potenciálně infekční materiály a měly by být připravovány v boxu s laminárním prouděním.

• Tento test musí být proveden v souladu se správnou laboratorní praxí.

• Nepoužívejte kit po datu expirace.

• Vyhněte se opakovanému rozmrazování a zmrazování činidel, může to snížit citlivost testu.

• Jakmile jsou reagencie rozmrazeny, promíchejte je na vortexu a krátce odstřeďte zkumavky před použitím.

• Rychle připravte reakční směs na ledu nebo v chladícím bloku.

• Vymezte dvě samostatné pracovní oblasti:

1) Izolace RNA/DNA

2) Amplifikace/detekce amplifikačních produktů.

• Pipety, zkumavky a jiné pracovní materiály by neměly cirkulovat mezi pracovními jednotkami.

• Vždy používejte sterilní špičky s filtry.

• V každé oblasti noste samostatné pláště a rukavice.

• Nepipetujte ústy. V laboratoři nejezte, nepijte, nekuřte.

• Vyhněte se aerosolům.

Odběr vzorků, skladování a přeprava

• Odebírejte vzorky do sterilních zkumavek;

• Vzorky lze okamžitě extrahovat nebo zmrazit při -20°C až -80 °C.

• Přeprava klinických vzorků musí být v souladu s místními předpisy pro přepravu etiologických agens.

Postup

Extrakce DNA

DNA extrakční pufr je součástí kitu, prosím důkladně rozmrazte pufr a před použitím krátce odstřeďte v odstředivce. Je lepší použít komerční kit pro extrakci nukleových kyselin.

1) Napipetujte 50 µl vzorku (sérum nebo exsudáty z lézí rozpuštěné v 1 ml fyziologického roztoku) do 0,5ml zkumavky, přidejte 50µl DNA extrakčního pufru, uzavřete zkumavku a poté 10 sekund vortexujte. Krátce odstřeďte na stolní odstředivce.

2) Inkubujte zkumavku 10 minut při 100 °C.

3) Centrifugujte zkumavku při 13000 ot./min po dobu 10 minut. Supernatant obsahuje extrahovanou DNA a lze ji použít jako templát pro PCR.

Interní kontrola

Do reakční směsi je nutné přidat interní kontrolu (IC). Interní kontrola (IC) umožňuje uživateli stanovit a kontrolovat možnost inhibice PCR.

Přidejte interní kontrolu (IC) 1 µl/rxn a výsledek se zobrazí v HEX/VIC/JOE.

Kvantifikace

Kit lze použít pro kvantitativní nebo kvalitativní RT PCR v reálném čase.

Pro provádění kvantitativní PCR v reálném čase se musí nejprve připravit ředění standardu podle schématu níže. K ředění se používá voda molekulární jakosti.

Krok ředění není nutný pro provedení kvalitativního PCR v reálném čase.

Vezměte pozitivní kontrolu (1×10^7 kopií/ml) jako výchozí maximum standardu v první zkumavce. Respektive napipetujte 36μl vody molekulární jakosti do dalších tří zkumavek. Proveďte tři ředění podle schématu níže:

Pro generování standardní křivky na systému v reálném čase, všechny čtyři standardy ředění by měly být použity a měly by být definovány jako standardy s odpovídající koncentrací.

Pozor:

A. Před dalším přenosem důkladně promíchejte.

B. Pozitivní kontrola (1×10^7 IU/ml) obsahuje vysokou koncentraci cílové DNA. Proto buďte při ředění opatrní, abyste se vyhnuli kontaminaci.

Protokol PCR

Objem Master Mixu pro každou reakci by měl být pipetován následovně:

*Tento systém je pouze pro Smart Cycler II

5. PCR systém bez HEX/VIC/JOE kanálu může být ošetřen s 1 µl vody molekulární jakosti místo 1 µl IC.

1) Objemy reakční směsi a směsi enzymů na reakci vynásobte počtem vzorků, který zahrnuje i počet kontrol, standardů a připravených vzorků. Voda molekulární jakosti je použita jako negativní kontrola. Z důvodů nepřesného pipetování vždy přidejte další virtuální vzorek. Zcela promíchejte a poté odstřeďte krátce v odstředivce.

2) Napipetujte 36 µl (22,5 µl pro SmartCycler II) Master Mixu mikropipetou se sterilní špičkou s filtrem do každé real time PCR destičky/zkumavky. Samostatně přidejte 4 µl (2,5 µl pro SmartCycler II) DNA vzorku, pozitivní a negativní kontroly do různých reakčních destiček/zkumavek. Okamžitě uzavřete destičku/zkumavky, abyste se vyhnuli kontaminaci.

3) Krátce odstřeďte, aby se Master Mix shromáždil na dně reakčních zkumavek.

4) Spusťte v přístroji následující protokol

Pokud používáte systém ABI Prism®, vyberte prosím „žádný“ jako pasivní referenci a zhášeč.

Nastavení prahu: těsně nad maximální úrovní vody molekulární jakosti.

Kalibrace pro kvantitativní detekci: Zadejte koncentraci každé standardní kontroly na konci cyklu a automaticky se vytvoří standardní křivka.

Kontrola kvality: Negativní kontrola, pozitivní kontrola, interní kontrola a QS křivka musí být provedena správně, jinak výsledky vzorku jsou neplatné.

Analýza dat a interpretace: následující příklady výsledků jsou možné:

Pro použití s ABI Prism® 7000/7300/7500/7900/Step One Plus; iCycler iQ™4/iQ™5; Smart Cycler ll; BioRad CFX 96; Rotor Gene™ 6000; Mx3000P/3005P; MJ-Option2/Chromo4; LightCycler®480 přístroj.