Rapid COVID-19 PoaCheck ™ kit pro detekci koronaviru (2019-nCoV)

Detailní popis

1. Účel použití

Rapid COVID-19 PoaCheck ™ je test RT-PCR v reálném čase určený pro kvalitativní detekci

RNA ze SARS-CoV-2 ve výtěrech z nosohltanu, nosu a orofaryngu od osob podezřelých na COVID-19, který provádí jejich poskytovatel zdravotní péče. Testování je omezeno na laboratoře - certifikované podle Clinical Laboratory Improvement Amendments z roku 1988 (CLIA), 42 U.S.C. §263a, pro provádění vysoce komplexních testů, nebo na podobně kvalifikované neamerické laboratoře.

Výsledky jsou pro identifikaci SARS-CoV-2 RNA. SARS-CoV-2 RNA je obecně detekovatelná v horních cestách dýchacích během akutní fáze infekce. Pozitivní výsledky svědčí o přítomnosti SARS-CoV-2 RNA; klinická korelace s anamnézou pacienta a dalšími diagnostickými informacemi jsou nezbytné k určení stavu infekce pacienta. Pozitivní výsledky nevylučují bakteriální infekci nebo koinfekci jinými viry. Detekovaný virus nemusí být jednoznačnou příčinou choroby. Laboratoře ve Spojených státech a na jejich územích jsou povinny hlásit všechny pozitivní výsledky příslušným orgánům veřejného zdraví.

Negativní výsledky nevylučují infekci SARS-CoV-2 a neměly by být používány jako jediný podklad pro rozhodnutí o managmentu pacienta. Negativní výsledky musí být kombinovány s klinickými pozorováními, anamnézou pacienta a epidemiologickými informacemi.

Rapid COVID-19 PoaCheck ™ je určen pro použití kvalifikovaným a školeným personálem klinických laboratoří, kteří byli speciálně vyškolení v technikách PCR v reálném čase a diagnostických postupech in vitro. Validace tohoto testu nebyla přezkoumána FDA – schválení v rámci programu EUA čeká na vyřízení.

2. Shrnutí a vysvětlení testu

Kit Rapid COVID-19 PoaCheck ™ (gen Orf1a) byl navržen pro amplifikaci cílového genu Orf1a COVID-19 (2019-nCoV) v izotermickém reakčním stavu.

LAMP (izotermická amplifikace zprostředkovaná smyčkou) zahrnuje Bst polymerázu, která má schopnost vytěsňovat řetězec při syntéze DNA, a 3 sady primerů. Nejprve se vnitřní primer váže na DNA a prodlužuje se, což způsobuje vytěsnění vlákna a první vlákno se uvolní. Vytvoří se smyčková struktura z 5'-konce odděleného jednovláknového řetězce a stejný proces se opakuje na 3'-konci a smyčková struktura je prodloužena. Pro provedení LAMP se používají čtyři různé primery určené pro specifické rozpoznání šesti odlišných míst genu, které mají být amplifikovány. Další pár „smyčkových“ primerů" může dále urychlit reakci. Ve srovnání s rozpoznáváním dvou míst v genu při klasickém PCR má LAMP velmi vysokou specificitu pro cílovou DNA. Primery použité v tomto kitu jsou navrženy tak, aby amplifikovaly gen Orf1a COVID-19.

Ve srovnání s klasickou metodou PCR, která rozpoznává dvě místa v genu, má LAMP vyšší specificitu, protože primery jsou navrženy tak, aby rozpoznávaly šest míst v genu.

Vzhledem k vlastnostem izotermické amplifikace nedochází ke ztrátě nebo poškození RNA / DNA změnami teploty. Účinnost amplifikace je velmi vysoká, a protože regulace teploty není potřeba, zkracuje se doba reakce (65 ℃, 30 min).

3. Principy postupu

Rapid COVID-19 PoaCheck ™ je reverzní transkriptázová polymerázová řetězová reakce v reálném čase (rRT-PCR). Sada primerů a sond SARS-CoV-2 je určena k detekci RNA z SARS-CoV-2 v nasofaryngeálních, nosních nebo orofaryngeálních výtěrech od pacientů s podezřením na COVID-19 poskytovatelem zdravotní péče.

Princip testu

Rapid COVID-19 PoaCheck ™ je diagnostický kit založený na amplifikaci specifické části genu Orf1a nového koronaviru metodou LAMP po dobu 30 minut při 65 °C. Výsledky jsou potvrzeny prostřednictvím přístroje PCR v reálném čase a pozitivní výsledky testu jsou měřitelné během 5 až 20 minut, k potvrzení negativity je zapotřebí dalších 10 minut.

Izotermická amplifikace zprostředkovaná smyčkou (LAMP)

Izotermická amplifikace zprostředkovaná smyčkou (LAMP) je izotermická amplifikace genu poprvé vyvinuta Notomi a kol. v roce 2000, ale na rozdíl od DNA Taq polymerázy používané v běžné PCR diagnostice, Bst DNA polymeráza amplifikuje cílový gen ve velkém množství metodou vytěsnění vlákna. Proto LAMP diagnostická metoda je mnohem efektivnější. Kromě toho, na rozdíl od běžné PCR, genová amplifikace se provádí v izotermických podmínkách bez změny teploty, což nejen zkracuje dobu testu, ale také umožňuje používat levné zařízení, jako je vodní lázeň. Také specificita metody je vyšší než u stávajících PCR diagnostických metod, protože amplifikace se provádí pomocí 4-6 specifických sad primerů, které jsou jedinečné pro 6-8 oblastí cílového genu. LAMP má vysokou citlivost s účinností amplifikace 10⁹ kopií nebo vyšší při hodinové době reakce.

Vzhledem k povaze LAMP, která probíhá za izotermických podmínek, je možné ji provádět pouze pomocí zařízení udržující konstantní teplotu, takže jej lze snadno použít v první linii v klinické praxe nebo na klinických pracovištích, která nemají drahé speciální vybavení ani odborný personál. S těmito výhodami se LAMP již používá po celém světě k diagnostice různých patogenů u lidí i zvířat.

V LAMP PCR jsou čtyři primery, vnější přímý primer, vnitřní přímý primer, vnější zpětný primer a vnitřní zpětný primer. Amplifikace se iniciuje od vnitřní přímého primeru. DNA polymeráza prodlužuje primer a odděluje cílový DNA duplex. První produkt se poté projeví syntézou iniciovanou vnějším přímým primerem, který nasedne před cílovou oblast. Když je první produkt vytěsněn, 5' konec produktu tvoří samohybridizující smyčkovou strukturu, a to díky zahrnutí sekvence zpětného primeru do sekvence vnitřní přímého primeru. Tento cyklus nasedání a vytěsnění se opakuje na opačném konci cílové sekvence. Výsledným produktem je LAMP struktura „činky“ (oba konce ohraničené smyčkami), která slouží jako základ pro amplifikaci. Tato LAMP struktura má více míst pro zahájení syntézy. Z 3' konce otevřených smyček a obou přímých i zpětných vnitřních primerů, jak pokračuje amplifikace na těchto místech, produkt roste a tvoří dlouhé konkatemery, každý s více iniciačními místy. Výsledek je rychlá akumulace produktů a amplifikace vedlejších produktů, které mohou být detekovány řadou metody.

Podrobné video s vysvětlením principu LAMP najdete na:

https://www.youtube.com/watch?v=L5zi2P4lggw

Proces testování: Shrnutí

            1                      2                       3                        4

1. Odběr vzorku od podezřelé osoby

2. Příprava nukleové kyseliny 

3. Jednokroková LAMP reakce v reálném času 

4. Analýza dat