ALLin™ Isothermal 1Step RNA Amplification Kit

Detailní popis

Součástí soupravy je směs RT5, směs termostabilní reverzní transkriptázy a vysoce účinného inhibitoru RNázy, která slouží k počáteční syntéze cDNA z templátů RNA.

CDNA je amplifikována polymerázou Bst. Sada obsahuje 2X master mix s optimalizovaným vysoce účinným pufrem, dNTP a rekombinantním velkým fragmentem Bst polymerázy, který má silnou aktivitu vytěsňování 5' - 3' vlákna a účinnou aktivitu 5'-3' polymerázy pracující při 55-70 °C. Polymeráza nemá 5' - 3' ani 3' - 5' exonukleázovou aktivitu a zachovává si pouze malou aktivitu reverzní transkripce.

Souprava obsahuje také vodu pro PCR; uživatel musí dodat pouze templáty a primery. Kvantitativní fluorescenční barvivo, 20X, je součástí dodávky pro volitelné použití, pro detekci v reálném čase v kanálu FAM na jakémkoli qPCR cykleru. Sada ALLin™ Isothermal 1Step RNA Amplification Kit je nástrojem volby pro izotermickou amplifikaci templátů RNA a takové aplikace, jako je RT LAMP, s další výhodou reakcí s vyšší teplotou, což zefektivňuje amplifikaci komplexních a na GC bohatých templátů.

Technické vlastnosti Bst DNA Polymerase large fragment:

Silná aktivita vytěsňování 5' - 3' vlákna
5'-3' polymerázová aktivita
Žádná 5' - 3' exonukleázová aktivita
Žádná 3' - 5' exonukleázová (korekturní) aktivita
Menší aktivita reverzní transkriptázy
Optimální amplifikační teplota je 65 °C.
Rozsah pracovních teplot je 55-70 °C.
Enzym Bst se inaktivuje za 10 minut při 80 °C.
RT5 Mix obsahuje termostabilní reverzní transkriptázu (modifikovanou MMuLV) pracující při vysokých teplotách a termostabilní inhibitor RNázy chránící templátovou RNA před degradací.
Optimální doba amplifikační reakce 1Step RT je 30 minut, v případě potřeby lze reakci provádět 30 až 60 minut.
Kvantitativní fluorescenční barvivo má excitační maximum při 482 nm a emisní maximum při 512 nm.
Použití tohoto produktu v určitých aplikacích může být předmětem patentů. Uživatel musí analyzovat všechny příslušné licence pro omezené použití označení a v některých případech může potřebovat licenci.

Tipy pro dosažení nejlepších výsledků přímé PCR nebo amplifikace surového vzorku PCR:

Pokud přímá amplifikace PCR nefunguje, snižte množství vstupního vzorku, například použijte méně materiálu bakteriálních kolonií nebo méně tkáně.

          U některých vzorků může být nutné provést jednoduchou lýzu pomocí proteinázy K, lysozymu nebo komerčně dostupných lyzačních pufrů pro přímou amplifikaci PCR.
          Vyzkoušejte různá ředění lyzovaného vzorku pro amplifikaci PCR.
          Vyberte primery s vysokou specifičností a účinností pro cílovou sekvenci, abyste zajistili úspěšnou amplifikaci.
          Při práci se surovými vzorky používejte pouze polymerázu DNA s horkým startem nebo master mix pro dosažení nejlepšího výsledku amplifikace.
          Určete optimální teplotu žíhání provedením teplotního gradientu PCR, abyste zvýšili vazbu a specifičnost primerů.
          Prodlužte denaturační krok, abyste zajistili úplnou denaturaci DNA, zejména u surových vzorků s potenciálně větším množstvím inhibitorů, které mohou být při zahřívání degradovány.
          Zahrňte pozitivní kontrolu (známý templát DNA/primery) a negativní kontrolu (bez templátu) k ověření výsledků amplifikace PCR.