HighYield T7 sgRNA Synthesis Kit (SpCas9)

Detailní popis

Pro všeobecné laboratorní použití.

Přeprava: dodává se v gelových obalech

Podmínky skladování: skladujte při -20 °C
vyhněte se cyklům zmrazování a rozmrazování

Skladovatelnost: 12 měsíců od data dodání

Popis: V případě potřeby je možné použít i jiné přípravky:
Sada HighYield T7 sgRNA Synthesis Kit (SpCas9) je určena pro syntézu jedno-řízených RNA (sgRNA) specifických pro SpCas9 bez klonování pomocí transkripce in vitro. SgRNA přímo rozpoznávají sekvenčně specifickou DNA, jakmile se zkomplexují se Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9)[1,2]. Výsledný komplex sgRNA/SpCas9 ribonukleoprotein (RNP) tak může být použit pro místně specifické štěpení, niking nebo vazbu dsDNA jak in vitro, tak v živých buňkách v závislosti na volbě varianty SpCas9 (např. divoký typ, nickase (D10A), nuclease deficient(D10A/H840A)). Ke štěpení, nikasování nebo vazbě varianty SpCas9 dochází před rozpoznávací sekvencí DNA specifickou pro SpCas9 5'-NGG-3' (sekvence protospacer adjacent motif (PAM), N = libovolná nukleotidová báze).

Syntézu DNA templátu kódujícího sgRNA pro in vitro transkripci zprostředkovanou T7 RNA polymerázou lze snadno provést bez klonování pomocí PCR sestavy s dodaným scaffoldem SpCas9 a promotorem T7 obsahujícím PCR primer[2]. Je třeba dodat pouze oligonukleotid specifický pro cíl (přibližně 60 nt). Amplifikace se provádí pomocí polymerázy Ultra DNA (známé také jako Phusion High-Fidelity Polymerase), aby byla zajištěna nejvyšší přesnost sekvence a také tvorba tupých konců. Směs surové PCR lze přímo použít jako templát pro transkripci in vitro.

Sada HighYield T7 sgRNA Synthesis Kit (SpCas9) obsahuje dostatečné množství činidel pro 50 reakcí sestavení PCR a in vitro transkripce. Jiné šablony DNA T7 kódující (s)gRNA (např. s jiným scaffoldem nebo pro jiné Cas endonukleázy) lze účinně přepisovat in vitro pomocí sady HighYield T7 RNA Synthesis Kit (#RNT-101).

Obsah:
Ultra DNA Polymerase[*]
1x 30 μl (2U/μl) ve skladovacím pufru s 50% glycerolem (v/v).
[*]také známá jako Phusion High-Fidelity Polymerase

Reakční pufr Ultra DNA sgRNA
1x 600 μl (5x)

směs dNTP
1x 100 μl (10 mM)

T7fwd_sgRNA
1x 60 μl (100 μM)
5'-GGATCCTAATACGACTCACTATAG-3'

T7rev_sgRNA
1x 60 μl (100 μM)
5'-AAAAAAGCACCGACTCGG-3'

SpCas9 scaffold
1x 60 μl (1 μM)
5'-AAAAAAGCACCGACTCGGTGCCACTTTTTCAAGTTGATAA
CGGACTAGCCTTATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAAC-3'

Kontrolní oligo HPRT
1x 15 μl (1 μM)

HighYield T7 RNA Polymerase Mix
3x 40 μl včetně inhibitoru RNázy a 50 % glycerolu (v/v)

Reakční pufr HighYield T7
1x 200 μl (10x), na bázi HEPES

ATP - roztok
1x 100 μl (100 mM)

GTP - roztok
1x 100 μl (100 mM)

CTP - roztok
1x 100 μl (100 mM)

UTP - roztok
1x 100 μl (100 mM)

Voda pro PCR
2x 1,2 ml

DTT
2x 100 μl (100 mM)

Dodá uživatel
Cílově specifické oligo
Nástroje pro purifikaci RNA
DNAse I bez RNAse

1. Prevence kontaminace RNAse
Přestože je součástí balení silný inhibitor RNázy, vytvoření pracovního prostředí bez RNAse a udržování roztoků bez RNAse je rozhodující pro provedení úspěšných in vitro transkripčních reakcí. Proto doporučujeme

    provádět všechny reakce ve sterilních zkumavkách bez RNAse za použití sterilních pipetovacích špiček.
    při manipulaci se vzorky obsahujícími RNA používat rukavice.
    udržovat všechny složky pevně uzavřené jak během skladování, tak při postupu reakce.

2. Návrh cílově specifického oligonukleotidu

    Podrobnější informace naleznete v našich základních informacích o návrhu cílově specifického oligonukleotidu: www.jenabioscience.com/images/741d0cd7d0/Target-specific_oligonucleotide_design_for_RNT-105.pdf.

3. Syntéza DNA templátu T7 kódujícího sgRNA

    Připravte 100 μM zásobní roztok cílově specifického oligonukleotidu (viz bod 2.) s vodou PCR kvality.
    Sestavte PCR reakci na ledu, voretexujte a krátce roztočte.

[*]také známý jako Phusion High-Fidelity DNA Polymerase

    Proveďte reakci PCR za použití následujících podmínek cyklování.
    Analyzujte 5 μl reakční směsi PCR na 2% agarózovém gelu. Očekávaná velikost produktu je 127 nt.
    Pro následnou transkripci in vitro není nutná purifikace.

4. syntéza sgRNA pomocí transkripce in vitro
Protokol je nastaven pro 5 μl směsi PCR jako templát DNA T7 kódující sgRNA (viz bod 3), ale může být nutná individuální optimalizace. Lze použít i purifikované T7 DNA templáty z různých zdrojů (1-2 pmol na 20 μl reakce).

    Umístěte směs HighYield T7 RNA Polymerase Mix na led.
    Všechny zbývající složky rozmrazte při pokojové teplotě (RT), promíchejte voretexováním a krátce roztočte.
    Všechny složky při RT sestavte do mikrozkumavky bez nukleázy (sterilní pipetovací špičky) v následujícím pořadí:
    Smíchejte PCR vodu, reakční pufr HighYield T7 a DTT voretexováním a krátce odstřeďte.
    Přidejte roztoky nukleotidů a DNA templát kódující sgRNA (např. 5 μl PCR směsi z oddílu 3), vortexujte a krátce odstřeďte.
    Přidejte směs HighYield T7 RNA Polymerase Mix, vortexujte a krátce odstřeďte.
    Inkubujte 2 h při 37 °C ve tmě (např. PCR cyklér). V závislosti na sekvenci RNA může individuální optimalizace zvýšit výtěžnost produktu (0,5-4 h při 37 °C).
    Analýza 1 μl in vitro transkripční reakce na 2% agarózovém gelu.

Upozornění: Reagencie pro následující kroky nejsou součástí této sady.

Odstranění šablony DNA
V závislosti na následné aplikaci může být vyžadováno odstranění templátu DNA. Doporučujeme vysoce účinnou DNAázu odolnou vůči solím, například Turbo™DNAse (ThermoFisher). Postupujte podle pokynů výrobce.

Odstranění 5'-trifosfátových skupin
5'-konce in vitro fosforylovaných RNA nesou trifosfátovou skupinu, o níž je známo, že u savčích buněk spouští vrozenou imunitní odpověď zprostředkovanou RIG-1 [3,4]. U sond RNA určených pro transfekční experimenty se proto doporučuje odstranění fosfatázami (např. CIP) před konečným přečištěním. Podrobnější informace naleznete v následujících odkazech: [3],[4].

Purifikace RNA
Purifikace RNA je nutná pro určité aplikace, jako je měření koncentrace RNA. Purifikace na spinové koloně odstraní proteiny, soli a neinkorporované nukleotidy. Postupujte podle pokynů výrobce a ujistěte se, že kolony odpovídají velikosti produktu a mají dostatečnou vazebnou kapacitu (např. ≥ 50 μg RNA Clean & Concentrator™ columns (Zymo Research) nebo Monarch® RNA Cleanup kit (NEB)). Jiné metody čištění RNA, jako je srážení LiCl, mohou fungovat, ale nebyly testovány.

Kvantifikace RNA
Koncentraci RNA lze stanovit měřením absorbance při 260 nm (A260) podle zákona Lambert-Beer (A260 = 1 odpovídá 40 μg/ml ssRNA).

Související produkty: Sada pro syntézu RNA T7 s vysokým výtěžkem, #RNT-101

(2012) A programmable dual-RNA guided DNA Endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science 337:816.
2] Modzelewski et al. (2018) Efficient mouse genome engineering by CRISPR-EZ technology [Efektivní genomové inženýrství myší pomocí technologie CRISPR-EZ]. Nature Protocols 13 (6) :1253.
[3] Wienert et al. (2018) In vitro transkribované vodicí RNA spouštějí vrozenou imunitní odpověď prostřednictvím dráhy RIG-I. PLoS Biol. 16 (7) :e2005840.
[4] Kim et al. (2018) CRISPR RNAs trigger innate immune responses in human cells (CRISPR RNAs spouštějí vrozenou imunitní odpověď v lidských buňkách). Genome Res. 28 (3):367.