Zneuznaný konkurent PCR ?

26.07.2021 15:53

Jak známo příčinou onemocnění těžkým akutním respiračním syndromem COVID-19 je nákaza koronavirem označovaným jako SARS-CoV-2. Jako nový typ koronaviru představuje pro nás jako jeho potencionální hostitele značnou výzvu svou schopností se nám v dnešním globalizovaném světě prakticky neomezeně šířit v podobě tzv PANDEMIE.

Jeho proměnlivý genom se vyskytuje v několika variantách a mutacích, kterých od počátku pandemie postupně přibývá úměrně k množství osob, v jejichž tkáních se množí. Některé z těchto odchylek ve složení jeho nevelkého genomu nemají na jeho nakažlivost (schopnost vstoupit do lidských buněk a v nich se množit) zásadní vliv, avšak některé tuto schopnost zřetelně zvyšují, což umocňuje riziko rychlejšího šíření nákazy.

Uvedený kit Rapid COVID-19 PoaCheckTM vyráběný firmou BioPoa Co.Ltd. je založen  na amplifikaci technikou LAMP (Loop-Mediated Isothermal Amplification), bez cyklického střídání teplot ve srovnání s PCR), která je založena na použití polymerázy Bst, která si sama odděluje řetězce již syntetizované, aby mohla pracovat na osamoceném řetězci. Podobně jako PCR tato technologie používá řadu specifických primérů k odstartování a zajištění průběhu reakce, která je v případě uvedeného kitu namířena do oblasti genomu koronaviru označované jako Orf1a. Uvedená oblast virového genomu je vysoce konzervativní – pravděpodobnost mutační změny v oblasti vazby primérů je velice nízká.

Popisovaná metoda má výhodu:                                                                                            

1) ve vysoké specifičnosti (vyšší než PCR), neboť sada primérů je směřována na 6 míst ve virovém genomu (PCR obvykle jen na 2 mista),                                                                         

2) v nárocích na vybavení laboratoře (vystačí s termostatem  udržujícím teplotu 650C) tak i nízkou časovou náročností na provedení (inkubace 20-30 minut),                                             

3) v jednoduchosti provedení, kdy stačí smíchat vzorek se směsí primérů s barvivy,                

4) ve vybavení kitu kontrolním vzorkem obsahujícím plasmid.

Jihokorejská firma BioPOA Co. Ltd. Se převážně věnuje oblasti biofarmaceutuckého výzkumu a řešení navazujících problémů např. s diagnostikou, přípravou očkovacích látek a dalších služeb např.ve virologii.

Její výrobky jsou certifikovány i v EU (Německo EUA, CE)

 

SLOŽENÍ KITU         

          NÁZEV                                                         MNOŽSTVÍ                                                                               1 COVID-19 Orf1a směs genových primerů                            300 μL,

2 LAMP reakční směs                                                 1mL,

3 Pozitivní kontrola (Orf1a)                                       30 μL,

4 Voda molekulární čistoty                                          1mL,

5 LAMP barvivo (FAM)                                             40 μL,

 

 

Příprava reakce

 

Počet reakcí /μL

1

8

16

32

Směs primérů

3

24

48

96

LAMP reakční směs

10

80

160

320

voda

4,6-1,6

36,8-12,8

73,6-25,6

147,2-51,2

LAMP barvivo

0,4

3,2

6,4

12,8

RNA

2,0-5,0

2,0-5,0

2,0-5,0

2,0-5,0

Celkový objem

20

160

320

640

 

Q ’ ty / 100 rxn

POZNÁMKY

(Rapid COVID-19 PoaCheckTM test je úspěšně použitelný i v polovičních množstvích, takže deklarovaných 100 testů, ve skutečnosti reprezentuje možnost otestovat až 200 vzorků).

Vzorky: naso/orofaryngeální a nosní výtěry, sputum (udržované do 72 hodin při 40C, po delší dobu při -700C)

Extrakce virové RNA: běžné kity, nebo vlastní příprava (Izolovanou RNA udržovat při-700C)

Přístroje a nářadí a spotřební materiál: Lze použít cyklery pro PCR, Vortex, Mikrocnetrifuga,  Sterilní špičky, Mikropipety, Lednice a Mrazící box, Stojánky na zkumavky, Nádoby na odpad typu Biohazard.

Příprava reakčních směsí a reagencií: zásadně na ledu

Hodnocení výsledku: limitní doba inkubace pro uznání pozitivity je do 30 minut, po ní lze  výsledek hodnotit jako negativní.

Kit naleznete zde: https://eshop.biogen.cz/rapid-covid-19-poacheck-kit-pro-detekci-koronaviru-2019-ncov

Komentář

Technika izotermální amplifikace je známa již ze začátku devadesátých let minulého stolení, ale zdá se, že teprve nyní vstupuje do povědomí klinických laboratoří, které se zabývají diagnostikou založenou na analýzách  nukleových kyselin. Množení nukleových kyselin probíhá na jednotlivých řetězcích, které u dvouřetězcových molekul musí být nejprve osamoceny. To se děje u daleko známější metody PCR -  polymerázové řetězové reakce zvýšením teploty tak, aby byly zrušeny meziřetězcové vodíkové vazby. Zvýšená teplota však inaktivuje běžné polymerázy, a proto jsou při PCR používány polymerázy termorezistentní nejčastěji tzv Taq z Thermus acquaticus. Ani ty však nevydrží při denaturačních teplotách dlouho. Jejich zkáze je bráněno cyklováním teplot, při nichž je volena doba pro denaturaci(oddělení řetězců), po které následuje ochlazení, co nejkratší.

Při izotermální amplifikaci riziko denaturace polymerázy zvýšenou teplotou odpadá a oddělení řetězců je svěřeno systému polymerázy samotné. Takovou je např. polymeráza Bst upravený produkt Bacillus stearothermophilus (https://www.nippongene.com/english/product/modifying-enzymes/bst-dna-polymerase.html).

V poslední době se objevují další úpravy izotermální amplifikace např. LMTIA (ladder-shape melting temperature isothermal amplification), na kterou upozornil E.Torrington v BioTechniques v červenci t.r.

Izotermální amplifikace má proti PCR výhodu ve zcela minimálních nákladech na přístrojové vybavení (vystačí s termostatem udržujícím teplotu 650C). Amplifikace obvykle probíhá 20-30 minut a proces bývá sestaven tak, že dosahuje bezkonkurenční specificity a citlivostí se PCR take nejspíš vyrovná. Pracovně je v podobě nabízených kitů nenáročná.